体外转录的信使RNA（IVT mRNA）已被广泛用于基因功能研究和RNA治疗技术。在体外转录过程中，会产生双链RNA（dsRNA）副产物。IVT mRNA中的dsRNA副产物会导致强烈的先天免疫反应，甚至导致人体出现休克症状，此外，dsRNA副产物也会降低治疗性mRNA的翻译水平，弱化其治疗效果。

显然IVT mRNA在用于RNA疗法之前，需要进行严格的质量控制。用小鼠和哺乳动物细胞进行质量检测需要将IVT mRNA进行LNP脂质体包装，然后再通过尾静脉注射或者细胞转染的方式将IVT mRNA导入，检测干扰素上调的水平。这些方法步骤繁琐，花费高，时间长，因此目前缺少快速廉价的dsRNA在体检测方法。

我们研究发现IVT mRNA中的dsRNA污染物会在斑马鱼早期胚胎中引起一种前所未见的应激反应。dsRNA通过PKR-eIF2α非依赖的方式引起全局蛋白质翻译抑制，并导致p53的激活。在缺乏IFN配体的情况下，p53强烈上调了包括干扰素刺激基因在内的大量基因的表达，如isg15、phlda3、phlda2、casp8和cdkn1a等。其中类泛素蛋白Isg15的大量表达可以通过增强ISGylation来降低蛋白通过泛素蛋白酶体降解的速度。这些发现使我们能够利用斑马鱼胚胎作为一种廉价、快速和敏感的体内系统来进行IVT mRNA和mRNA疫苗的质量控制。斑马鱼早期胚胎中的p53靶基因，如isg15、phlda3、phlda2、casp8和cdkn1a等的表达水平，可以帮助检测IVT mRNA中是否存在过多的dsRNA污染物。同时，dsRNA在斑马鱼早期胚胎中对luciferase报告mRNA翻译的抑制也可以作为检测标准。

isg15和phlda3表达对双链RNA的敏感性更高

A.经过纤维素层析降低三种IVTmRNA双链RNA的含量，利用J2抗体进行dot blot检测可以明显看出纤维素层析后双链RNA的量显著下降。

B.注射100 pg/胚胎dsRNA污染的cas9 mRNA可以导致phlda3和isg15的大量表达，原位杂交定性检测可以看到明显增强的染色信号。

C.qRT-PCR检测发现p53下游靶基因isg15、phlda3、cdkn1a和casp8都可以用于mRNA中双链RNA副产物的检测，在减少双链的IVT mRNA的刺激下，这些基因的表达水平明显下降。总体而言，isg15和phlda3的表达对dsRNA的刺激相比于另外两个基因更加敏感，因此更适用于进行dsRNA污染物的评估。